Главы 1.5 и 1.7. Техники подготовки пробы для ВЭЖХ и ГХ

Главы 1.5 и 1.7. Техники подготовки пробы для ВЭЖХ и ГХ

Сообщение Константин Сычев » Сб ноя 02, 2013 9:28 pm

Поставка ВЭЖХ оборудования Agilent и Gilson http://www.chromforum.ru/viewforum.php?f=47

1.5. Извлечение летучих компонентов

1.5.1. Статическая и динамическая парофазная экстракция

Для извлечения летучих целевых соединений нередко применяют парофазную экстракцию. Сущность этого подхода состоит в выделении из образца паров содержащихся в нем летучих соединений при помощи нагревания, пропускания тока инертного газа или при применении комбинации обоих воздействий. Агрегатное состояние образца может быть как жидким, так и твердым.
В том случае, когда паровую фазу выделяют в замкнутой емкости (обычно при небольшом нагревании до 40-80°С в течение 1-10 минут), подход называют статической парофазной экстракцией, СПЭ, или «хедспейс» (headspace) экстракцией. При выборе условий СПЭ стремятся к тому, чтобы состав паровой фазы был как можно ближе к равновесному, что крайне важно с точки зрения воспроизводимости анализа.
Динамическую парофазную экстракцию, ДПЭ, или «пёрдж-энд-трэп» (purge&trap) экстракцию, реализуют при пропускании через образец инертного газа, который захватывает с собой летучие соединения, которые затем каким-либо образом концентрируются – например, поглощаются твердым адсорбентом. При выборе условий ДПЭ стремятся к тому, чтобы по возможности количественно извлечь из образца целевые летучие соединения.
Оба подхода автоматизированы и устойчиво вошли в практику определения летучих соединений методом газовой хроматографии. Автоматический статический парофазный экстрактор состоит из термостата, автосэмплера с пробниками (которые выполняют также функцию экстракционных емкостей) и соединенной с аналитическим шприцем газовой линии, по которой проба паровой фазы попадает в газовый хроматограф. Все операции выполняются в непрерывном режиме согласно программе, введенной оператором.
Автоматический динамический парофазный экстрактор состоит из экстракционной емкости и газового крана, к которому присоединен т.н. термодесорбер – устройство с адсорбционными трубками, которые поглощают летучие соединения образца (10-15 минут), а по завершении экстракции при резком нагревании за 1-2 минуты высвобождают их. Термически десорбированные летучие соединения поступают в газовый хроматограф, где они конденсируются криомодулятором и затем вводятся в колонку.
Автоматическая динамическая парофазная экстракция широко применяется в экологическом анализе для определения летучих органических соединений в воде и почвах.
Для решения иных задач самой различной специфики применяют, как правило, менее дорогостоящий и более доступный метод статической парофазной экстракции. Он не только доступен, но и прост, что позволяет легко реализовать его и без применения автоматизированных устройств, то есть при работе вручную.
С другой стороны, у статической парофазной экстракции, как и любого равновесного метода, есть свои «подводные камни». Степень извлечения и особенно воспроизводимость результатов зависят от соблюдения нескольких правил, основанных на закономерностях СПЭ.
Рассмотрим ситуацию, когда образец жидкий. Эффективность СПЭ зависит от растворимости целевого вещества в жидком образце. Чем больше вещество растворимо в определенной жидкости, тем меньше давление насыщенного пара этого вещества над жидким образцом – и тем меньшая доля летучего вещества попадает в равновесную паровую фазу. К примеру, если водный образец содержит этанол и гексан, то после проведения СПЭ практически весь гексан переходит в паровую фазу, тогда как основная часть этанола остается в образце (в паровую фазу переходит очень малая часть этанола). Таким образом, плохо растворимые в образце летучие вещества экстрагируются методом СПЭ значительно эффективнее, чем хорошо растворимые.
Увеличить концентрацию целевого вещества в паровой фазе можно несколькими методами; основных методов два: это увеличение температуры и повышение объемно-фазового соотношения, то есть объема жидкого образца относительно всего объема экстракционного пробника. Повышение температуры экстракции дает видимый эффект только в том случае, когда целевое соединение хорошо растворимо в образце. В противном случае, когда вещество растворимо плохо и оно уже практически полностью находится в паровой фазе, этот способ не дает эффекта.
Напротив, повышение объемно-фазового соотношения приводит к видимому эффекту именно в том случае, когда оно плохо растворимо в образце. Поскольку такое вещество практически полностью находится в паровой фазе, увеличение объемной доли образца в емкости приводит к практически пропорциональному увеличению его концентрации в паровой фазе. Соответственно, повышение объемно-фазового соотношения не дает эффекта при СПЭ хорошо растворимых в образце веществ.
При СПЭ из водных образцов полярных, хорошо растворимых в воде соединений действенным способом повышения их концентрации в паровой фазе является высаливание, то есть добавление в образец неорганических солей в концентрации более 1М. Часто в качестве высаливающего агента применяют сульфат натрия или хлорид натрия.
Таким образом, при СПЭ из водного образца, к примеру, этанола целесообразно применять повышенную (до 80°С) температуру и высаливание. При СПЭ из водного образца гексана лучше увеличить в разумных пределах объемно-фазовое соотношение. «Разумный предел» составляет примерно β = 3, что соответствует 5 мл образца в 20 мл пробнике.
Необходимо отметить, что при проведении определения с примененем СПЭ из одного пробника (экстракционной емкости) делают одну инжекцию в хроматограф. Другими словами, в общем случае будет ошибкой делать из одного пробника несколько инжекций. Это может привести к существенной нестабильности количественных результатов, особенно для плохо растворимых в образце летучих соединений (которые находятся преимущественно в паровой фазе).
Теперь рассмотрим ситуацию, когда образец твердый. Здесь появляются два варианта. С одной стороны, парофазную экстракцию можно проводить непосредственно из твердого образца. С другой стороны, сначала можно провести жидкостную экстракцию твердого образца, а затем парофазную экстракцию первоначального жидкого экстракта. У каждого из подходов есть преимущества и недостатки.
Основным преимуществом непосредственной парофазной экстракции твердого образца является простота всей процедуры. Образец перемалывают (или нарезают) некоторым единообразным способом и переносят в экстракционный пробник; СПЭ, как правило, проводят при повышенной температуре. Недостаток подобного подхода заключается в том, что степень извлечения здесь весьма сильно зависит от матрицы образца, причем иногда даже для однотипных объектов. Соответственно, методики с применением СПЭ твердых образцов, как правило, имеют достаточно узкую область применения. Более того, при подобном подходе могут возникать неизбежные трудности с точным количественным анализом за редким исключением случаев, когда для градуировки можно приобрести подходящий стандартный матричный материал.
Этих недостактов лишен подход с промежуточной жидкостной экстракцией, минусы которого, в свою очередь, связаны именно с проведением дополнительной ресурсоемкой стадии жидкостной экстракции. К тому же, ЖЭ имеет свои ограничения (см. гл. «Жидкостная экстракция твердых матриц»).
Парофазную экстракцию, как правило, сочетают с газовой хроматографией, поскольку она идеально подходит для анализа летучих соединений. Тем не менее, ПЭ совестима и с жидкостной хроматографией. В варианте ДПЭ инертный газ с экстрагированными летучими веществами пропускают через некоторый объем подходящего растворителя; аликвоту полученной жидкой пробы инжектируют в хроматограф. В варианте СПЭ применяют жидкостную микроэкстрацию – паровая фаза контактирует одновременно с образцом и с очень малым (до одной капли) объемом растворителя в верхней части экстракционного пробника; в этом случае в хроматограф инжектируют весь объем полученной пробы.

1.5.2. Паровая дистилляция

Паровая дистилляция является широко распостраненным способом извлечения среднелетучих соединений с температурой кипения до 200°С. Идея метода заключается в том, что при одновременной дистилляции с водным паром целевые соединения возгоняются при температуре значительно более низкой, чем температура кипения чистых веществ.
Техника метода очень проста. Жидкий или твердый образец переносят в колбу вместе с достаточным количеством воды и нагревают смесь; конденсат через прямой холодильник попадает в приемную емкость.
Если извлекаемые летучие соединения не растворимы в воде (например, эфирные масла), они выделяются в виде отдельного органического слоя или эмульсии. Как правило, дистиллят в этом случае дополнительно экстрагируют неполярным растворителем. Если отгоняемые соединения растворимы в воде (например, метилфенолы), то дистиллят представляет собой раствор целевых веществ. В зависимости от ситуации их можно извлечь из дистиллята методом ЖЖЭ или ТФЭ, или же непосредственно использовать дистиллят как пробу.
Метод паровой дистилляции хорошо совместим и с газовой, и с жидкостной хроматографией.


1.5.3. Твердофазная микроэкстракция, ТФМЭ

Метод твердофазной микроэкстракции, ТФМЭ, основан на адсорбции соединений из жидких или газообразных образцов на капилляре, покрытым полимерной пленкой.
После проведения экстракции рабочий капилляр перемещается внутрь стальной иглы специального аналитического шприца. Игла выполняет две функции: защитной оболочки и интерфейса для прямого ввода адсорбированных соединений непосредственно в газовый хроматограф методом термодесорбции. Таким образом, ТФМЭ позволяет извлекать высоколетучие и среднелетучие соединения, которые способны к десорбции с поверхности рабочего капилляра при его кратковременном нагревании в инжекторе газового хроматографа.
Сменные рабочие капилляры можно использовать повторно, однако, количество экстракций на один капилляр закономерно уменьшается при преходе к более грязным матрицам. При ТФМЭ из паровой фазы на одном капилляре можно провести несколько сотен экстракций, тогда как при экстракции из насыщенных нелетучими соединениями жидких матриц, как правило, не удается использовать капилляр более нескольких раз.
Селективность экстракции можно варьировать, применяя капилляры с различной химией пленки: полидиметилсилоксаном (PDMS), полидиметилсилоксан-дивинилбензолом (PDMS/DVB), полиэтиленгликоль-дивинилбензолом (CW/DVB), полиакрилатом (PA). Для ТФМЭ сильнолетучих соединений и/или экстракции из паровой фазы выбирают капилляры с большей толщиной пленки, от 50 до 100 мкм. Для ТФМЭ среднелетучих соединений применяют пленки меньшей толщины вплоть до 7 мкм, которые обеспечивают более полную термодесорбцию.
При ТФМЭ из паровой фазы время экстракции составляет порядка 5 минут, а из жидких образцов – порядка 30 минут.




1.7. Высокоэффективные хроматографические методы подготовки пробы

1.7.1. Чем ЖХ отличается от ТФЭ. Колоночная ЖХ низкого давления

Нередко бывает нужно не просто очистить пробу, а дополнительно ее фракционировать, то есть разделить целевые соединения на несколько групп. Такая необходимость может быть вызвана самыми разными причинами. К примеру, если с одновременным определением всех целевых соединений возникают трудности. В некоторых случаях их можно избежать, проводя раздельные анализы выделенных фракций пробы, каждая из которых содержит лишь часть целевых соединений.
Для целей фракционирования ТФЭ не годится. Здесь нужен хроматографический метод. В этом месте часто имеет место быть некоторая путаница, поскольку почти нигде не рассказывают чем твердофазная экстракция отличается от хроматографии. По этой причине твердофазной экстракцией обычно называют процедуру с применением небольших и не очень эффективных картриджей, а хроматографию больше связывают с эффективными колонками. Все это не совсем корректно.
Хотя единой верной точки зрения здесь не может быть, я бы связывал хроматографию с фактом разделения на отдельные фракции группы целевых соединений. Если все целевые соединения элюируются в одной фракции, то этот случай следовало бы называть твердофазной экстракцией.
С этой точки зрения, ВЭЖХ разделение с on-column концентрированием, где определяют лишь одного целевое соединение на фоне матрицы – это типичный случай ТФЭ. И это несмотря на то, что разделение проводят на хроматографе с высокоэффективной колонкой.
Подобным же образом, если на ТФЭ картридже проводят последовательный смыв различных групп целевых соединений – это уже не ТФЭ, а хроматография. Несмотря на то, что применяют короткую и низкоэффективную колонку (картридж).
Последний случай является примером колоночной жидкостной хроматографии (ЖХ) низкого давления. Называется так этот способ потому, что для создания потока элюента здесь необходимо самое минимальное давление, которое могут обеспечить: собственный вес растворителя, сжатый воздух, небольшое ручное усилие. Соответственно, в данном случае необходимо применять крупнозернистые адсорбенты со средним размером частиц порядка 70-150 мкм, которые имеют низкое гидродинамическое сопротивление.
Часто для ЖХ низкого давления применяют колонки из стекла; их типичный диаметр – два-три сантиметра. Роль «длины колонки» играет высота слоя адсорбента, которая может варьироваться от нескольких сантиметров до 10-15 см. Адсорбент переносят в колонку, как правило, всухую; суспензионный способ заполнения применяют очень редко.
Выбор способа нанесения пробы зависит от конфигурации колонки. На небольшой картридж или небольшую короткую колонку (которые нередко изготавливают собственноручно из нарезанных по 5-10 см стеклянных пипеток или из стеклянных шприцев) пробу наносят в жидком виде, то есть как она есть.
На длинную колонку с небольшим слоем адсорбента пробу в жидком состоянии наносить не очень удобно. В этом случае можно использовать следующий способ. Вначале отдельно смешивают жидкую пробу с адсорбентом. Затем полученный адсорбент с сухим остатком пробы, влажный или специально высушенный под вакуумом, переносят в колонку, равномерно распределяя его поверх слоя адсорбента. Конечно, этот способ неприменим, если целевые соединения летучи.

1.7.2. Эксклюзионная ВЭЖХ

Среди видов высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) для нужд пробоподготовки чаще всего применяют не адсорбционные режимы, а эксклюзионный режим.
Этот подход становится потенциально интересным, когда группы целевых соединений различаются по величине молекулы; соответственно, их можно разделить на подходящей эксклюзионной высокоэффективной колонке. Если одновременно таким способом можно удалить из пробы и высокомолекулярные загрязняющие компоненты матрицы, то применение эксклюзионной ВЭЖХ в целях подготовки пробы становится особенно заманчивым.
Принято разделять эксклюзионные колонки на «водные» и «неводные». На «водных» колонках работают с гидрофильными образцами, к примеру, водорастворимыми белками. Такие колонки изготавливают либо из гидрофильных полимеров (ПВА, гидроксиметакрилат), либо получают химическим модифицированием силикагеля полярными веществами, к примеру, полиспиртами.
На «неводных» колонках работают с любыми образцами, растворимыми в полярных органических растворителях, как правило, ТГФ или дихлорметане. Такие колонки изготавливают либо из силикагеля, либо из гидрофобных полимеров, к примеру, нейтрального полистирол-дивинилбензола.
В аналитической ВЭЖХ экслюзионный режим применяют для определения ММР (молекулярно-массового распределения) полимеров. Для этой цели необходимо применять условия хроматографирования, при которых все адсорбционные механизмы полностью подавлены, то есть работает только эксклюзионный механизм.
Для целей же подготовки пробы адсорбционные механизмы совсем не обязательно следует подавлять. Более того, часто смешанные эксклюзионно-адсорбционные режимы используют вполне сознательно. Например, пытаются по эксклюзионному механизму разделить полимерные целевые вещества от мономерных целевых и разделить все целевые от высокомолекулярных компонентов матрицы, а по адсорбционному механизму – разделить на группы мономерные целевые соединения и отделить их от мономерных компонентов матрицы.
Другими словами, эксклюзионно-адсорбционную ВЭЖХ применяют при подготовке пробы лишь в самых тяжелых и непростых случаях. Пример: определение различных типов присадок в отработанных минеральных маслах.
Примечательно, что подобный подход можно применить и для решения задачи очистки неполярных экстрактов от триглицеридов. На микропористых полистирольных неподвижных фазах с размером пор менее 50 Å триглицериды отделяются от целевых срединений, обладающих небольшими компактными молекулами. К примеру, существует ряд специальных эксклюзионных ВЭЖХ фаз для очистки неполярных экстрактов жирных матриц, содержащих различные группы полихлорированных СОЗ.

1.7.3. Двумерная ВЭЖХ и ВЭЖХ-ГХ

Двумерную ВЭЖХ нередко применяют как метод ВЭЖХ, сопряженный с он-лайн подготовкой пробы. Как правило, в качестве «адсорбционного картриджа» рассматривают первую ВЭЖХ колонку; честно говоря, далеко не всегда она должна обладать очень высокой эффективностью.
Большинству хроматографистов хорошо знаком простейший пример он-лайн адсорбционной очистки для ВЭЖХ – применение предколонки, где предколонка (первая колонка) напрямую соединена с аналитической (второй) колонкой. Чисто с технической стороны этот вариант соединения плох тем, что сильно удерживаемые компоненты матрицы рано или поздно попадают в аналитическую колонку, что не всегда возможно оперативно отследить.
Более удобен вариант соединения предколонки и колонки через кран-переключатель. После прохождения целевых соединений через предколонку кран переключают; целевые соединения попадают в основную колонку, а предколонка промывается в обратном направлении. Жидкостную систему можно организовать таким образом, чтобы для промывки использовать элюат, поступающий из детектора после прохождения через аналитическую колонку.
Наконец, первая колонка в системе (а именно она в случае он-лайн пробоподготовки выполняет задачу по предварительному фракционированию пробы) может также иметь высокую эффективность. С первой колонки на вторую путем переключения крана переносят достаточно узкую фракцию элюата с целевыми веществами; таким образом, на первой колонке происходит предварительное разделение, а на второй – аналитическое («heart cut» метод, или метод «хроматографической лупы»).
Смысл в применении метода хроматографической лупы существут только в том случае, когда селективность первой и второй колонок не совпадает.
Здесь есть два варианта. Первый вариант: обе колонки выполняют разделения (одна – предварительное, другая – аналитическое) в одном хроматографическом режиме, и даже, возможно, работая на одной подвижной фазе. Тогда это должны быть колонки различного типа. К примеру, если речь идет об ОФ режиме, то одна может быть С18 фазой, а другая – С16-амидной, или нейтральной полимерной.
Второй и более интересный вариант состоит в том, что колонки работают в двух различных режимах (для этого хроматограф, помимо дополнительного переключающего крана, должен иметь по крайней мере два насоса высокого давления). Растворитель элюата из первой колонки должен обладать низкой элюирующей силой в том режиме, в котором работает вторая, аналитическая колонка.
В принципе, подходящих сочетаний режимов не так уж много. Я насчитал семь: «водный эксклюзионный-ОФ», «ионный-ОФ», «водный эксклюзионный-ионный», «неводный эксклюзионный-НФ/гидрофильный», «неводный эксклюзионный-ПЗ», «НФ-ПЗ» и «ПЗ-НФ».
ВЭЖХ может применяться и в качестве метода подготовки пробы для ГХ оределений. В этом случае ВЭЖХ соединяют через кран-переключатель с PTV-инжектором газового хроматографа. В ГХ переносят достаточно узкую фракцию с целевыми веществами. Применяемый в ВЭЖХ элюент должен быть достаточно летучим. Таким образом, предварительное ВЭЖХ фракционирование нельзя проводить в ОФ, водном эксклюзионном или ионном режимах, но допустимо в неводном эксклюзионном, НФ и ПЗ режимах.
С уважением,
к.х.н., Константин Сычев
Константин Сычев
Специалист
 
Сообщения: 319
Зарегистрирован: Чт дек 09, 2010 2:10 pm

Вернуться в К. Сычев. Подготовка пробы в ВЭЖХ и ГХ

Кто сейчас на конференции

Сейчас этот форум просматривают: нет зарегистрированных пользователей и гости: 1

cron