Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ): сайт технической поддержки

Доброго времени суток.
Не раз слышал как говорят о том, что мастера хроматографии посмотрев на формулу сразу говорят состав элюента и предсказывают приблизительное время выхода. Интересно было бы пообщаться на тему, кто какими соображениями руководствуются добавляя тот или иной компонент в состав подвижной фазы. Тема обширная (кислоты, соли, ион-парные и т.д.), поэтому прелагаю начать с кислот.
Добавляя кислоту в элюент я преследую цель - перевода в аналита в определенную форму, чаще всего молекулярную. Кроме того если в качестве детектора используется ESI-MS, то кислота (на этот случай обязательно летучая) повышает чувствительность. Какой еще функционал может нести кислота?

О, ну это слишком обширная тема. Это почти все управление селективностью. Это почти пол-хроматографии. Это все равно, что сказать "играть музыку легко, надо только нажимать нужные кнопки с нужное время"

По поводу предсказывания хроматографического поведения по формуле - это дело не только знания, но и постоянно поддерживаемого навыка. У меня были очень неплохие навыки, но они уже порядком забылись за семь лет. Превратились просто в знание, которое невозможно применить быстро в нужное время. Сейчас их восстанавливаю. Правда, это происходит довольно быстро - задачи попадаются зубастые.

Конечно, любое регулирование рН в точки зрения хроматографии (не детектирования) - это перевод в ту или иную форму. Вопрос-то не в том. Тут нужно знать - в каком случае какая форма тебе нужна.

Безусловно тема обширная тут и сомнений нет. ну на то и форум, подискутируем, а если кому интересно потом прочитают переписку и никому повторять ненадо. тем более он только начинает свое существование и тема в "пол-хроматографии" ему не помешает. ИМХО

А если анализировать апротонные вещества типа бензола, антрацена и т.п. Может ли значительно повлиять pH на его элюирование? за счет изменения поверхностного натяжения фазы соответственно смачивания НФ и т.д.

"...нужно знать - в каком случае какая форма тебе нужна." - вы писали в своей книге что очень удобно основания с кислотам разделять в кислой pH, когда первые в виде ионов, а вторые нейтральные молекулы. А если скажем у нас нет оснований, то можно и при pH где кислоты ионизированы расстащить только их за более короткое время. Это имели ввиду?

"Второй" по популярности добавкой является соль. Ранее я думал, что добавка соли уменьшает элюирующую силу воды высаливая на поверхнось НФ(т.е. "соленная вода" более слабый элюент чем дистиллят). Но на anchem вы писали про случай когда часть веществ увеличила свое время, а часть уменьшила Какой же эффект стоит ждать от соли добавляя ее в элюент, в каком случае целесообразно ее добавить?

Нет, для не акцепторов и/или не доноров протонов (в водных растворах, я имею в виду) рН никак повлиять на их удерживание не может.

Я не помню где я что там писал, надо долго разбираться)) я всего-то имел в виду, что, например, если основания (не хитрые какие-то там, а обычные) делить в лоб, то лучше среду выбирать с максимальным рН. Ну, на основе силикагеля если колонка - то просто ничего в элюент не добавлять, т.е. нейтральный рН. На полимере можно и подщелочить. Но это экзотика. А кислить (если кислот точно там нет) тогда не надо. Другое дело если разделение выбрано с ион-парной добавкой. Тогда как раз надо кислить, чтобы основания были до конца ионизированными. Все это приводит к тому, что системы устойчивы и воспроизводимы.
Но это простые случаи, тривиальные. Бывают вещества с, например, четырьмя основными группами и двумя кислотными, при этом так все расположено, что оно может хелатировать или еще какой-нибудь фокус показать, таутомеры там какие-нибудь, да все еще зависит от рН.. вот где страдание-то начнется

А соли.. это сложнее гораздо.. А почему Вы называете воду растворителем с большой элюирующей силой? Речь о гидрофильной (HILIC) хромтаографии?

Да виноват, не указал что речь идет об ОФ ВЭЖХ. Вот если я элюирую одно вещество в условиях Вода/Ацетонитрил 8:2 и Водный раствор соли/Ацетонитрил 8:2 ,т.е. соотношения одни разница в наличие соли в воде. То время выхода аналита во втором случае будет выше, так как соль высаливает вещество на неподвижную фазу (соленная вода слабее элюирует). Получается что чистая вода имеет большую элюирующую силу, чем подсоленная.
Раньше я всегда добавлял соль с целью увеличить время выхода аналита. Но после того примера, у меня возникли сомнения в вышеизложенной теории.

В вэжх так не принято - говорить об элюирующей силе: просто воды, кислой, соленой воды. Есть элюирующая сила воды и эффекты изменения рН и добавления соли. Дальше есть шкала элюирующей силы с точкой отсчета. В ОФ режиме за точку отсчета принята вода. Ее элюирующая сила по определению равна 0 (нулю). Если добавка соли вызывает увеличение удерживания, то это принято называть эффектом от добавки соли, а не "отрицательной" элюирующей силой соленой воды.

В общем и очень грубо говоря, добавка неорганической соли увеличивает удерживание в ОФ режиме и уменьшает в HILIC, ионнообменном. Но если механизм удерживания смешанный, то и действие соли получается разнонаправленным - примерно так.

Да неграмотно я выражался, исправлюсь. Спасибо за науку.
По поводу смешанного механизма, когда соль уменьшает в условиях ОФ время выхода искомых веществ. Под смешанным механизмом понимается совокупность нескольких механизмов, при чем они практически имеют одинаковую степень влияния. А может быть примером такой ситуации скажем, при анализе на колонке ОФ без эндкеппинга (или старой с оторванным эндкеппингом) и вещество будет одновременно в ОФ и HILIC условиях . Тогда добавка соли повлияет уже уменьшив время выхода, ну или не так уже предсказуемо как при одном преобладающем механизме.

Да, все так. В том примере так и было. На кислой воде добавление соли вызвало сильное увеличение удерживания никотинамида и уменьшение удерживания лимонной кислоты. А удерживание пиридоксина почти не изменилось.

Только "оторванный эндкэппиниг" - это миф у старой колонки просто растворяется часть силикагеля и происходит усадка паковки.

Как это определили (про эндкеппинг). Откуда уверенность в том, что ни фаза, ни эндкеппинг совсем не отрываются при работе в экстремальных условиях , а к уширению и хвостам приводят пустоты в сорбенте?

Я не определял есть классические работы.. кажется, Снайдера...

возвращаясь к теме. если варьирование pH, использование соли в различных концентрациях не позволило достаточно увеличить время выхода аналита тогда возможно перейти в другой режим (может HILIC если у нас полярное вещество), использовать более селективный детектор, или применить ион-парный реагент.Последний и касается темы
Какие требования можно выставить ион-парному реагенту? Главное чтобы он имел противоположный заряд по отношению к определяемому веществу, углеводородный радикал (если опять же говорить об ОФ), растворяться в элюенте. Что еще надо сказать об ион-парных реагентах?

И вообще склонен считать, при наличи возможности использования колонок с сорбентами с комбинированными свойствами (ионо-обменная, распределительная например) зачастую можно разделить вещества не принебрегая к ион-парному реагенту. Что вы скажите по этому поводу.

Отвечаю с конца)) последнее - поддерживаю.. думаю сам добраться в ближней перспективе до таких колонок и попробовать некоторые очевидные вещи.. у этого подхода, правда, есть один очевидный недостаток: количество или даже тип (хорошо предварительно помыв колонку) реагента можно изменить для подстройки селективности, а с колонкой готовой так не поступишь. Остаются игры с рН, а это очень нездорово в плане воспроизводимости... я к таким методикам с огромным подозрением всегда отношусь..

Требования к ион-парному (говорим об ОФ режиме).. наверное, адекватное удерживание на данном элюенте.. например, пентилсульфонат бесполезно использовать, если ацетонитрила больше 10%. надо что-нибудь "покрепче". иначе таких артефактов наловишь.. получается такая синергия.. что если соединение заряжено неплохо, да еще и со здоровой неполярной частью, то ион-парный режим становится очень проблематично использовать.. наверное, для этих случаев действительно лучше применять специальные смешанные колонки..

Ну, и первый вопрос.. на него трудно ответить, все слишком сильно зависит от ситуации.. да, можно переходить в HILIC.. но там оно может удерживаться так сильно, что его будет не вымыть.. или вымыть, но с таким трудом, что колонка быстро накроется.. или там не будет нужной селективности.. все что угодно.. если в ОФ удерживание есть, но недостаточное - есть специальные колонки.. типа С30, совместимых с водой.. до это уже экзотика большей частью.. есть колонки типа С16-амида, например, они что-то полярное нормально так могут потянуть..

Ну а собственно в чем подозрения к таким методикам? Указано четко значение, мы его воспроизводим делая серию вводов пробы в разных концентрациях. Муторно конечно и не всегда хочется, но возможно. Бывают ситуации что от методики не отойдешь.
Другое дело постановка новой методы, тут с pH лучше иметь дело для НФ и ОФ режима для стабилизации. Особенно если неподвижная фаза из древних к примеру чешских и ничего другого под рукой нет.

Да, Иван, подозрения такие, что с рН играться - это последнее дело, это совсем от плохой жизни.. значит, колонка не показывает нужной селективности, и вот он меняет рН в надежде методом тыка найти какой-то островок стабильности и приемлемого разрешения.. а насколько этот островок велик? вопроизведется ли он элементарно на похожей фазе?

Мне кажется, что ни одна методика с "рН-играми" не пройдет нормальной валидации.. и они существуют только пока эту нормальную валидацию не проводят.. но рано или поздно доберутся..

Касаемо "точного" pH. Я считаю, что такие методики имеют место быть при работе только в режиме повторяемости , т.е скажем какому-либо эксперту необходимо разделить вещества и получить устойчивую систему на 2-3 дня. Получил результат (есть или нету наркотиков и т.п.) и всё, задача одна такая была и воспроизводимость не нужна. В противном случае такая методика, принятая как воспроизводимая и опубликованная, требует от воспроизводящего её подбора "своих" условий . Не факт что еще подберет. А потом говорят о невоспроизводимости "буржуйских методик".
Но если говорить о реально "валидационной" методике, то склоняюсь к тому чтобы диапазон pH был несколько единиц. Вопрос в этой всвязи, почему именно на таких смешанных колонка будет только "островок" pH? Возможно что условия могут свестись к следующим --- pH менее 3,5 делает систему достаточно селективной (может такое быть). Тогда robust?
Кроме pH, температура будет ли рычагом управления селективностью такой колонки, как и у классической ОФ?

Ну вобщем да, все так.. за исключением того, что условия разделения, которые используются "в режиме повторяемости" и не прошли валидацию, не могут называться методикой.. это не методика, а просто частные условия разделения..

Конечно, запросто бывают такие частные условия разделения, что именно они подходят для решения задачи, а другие - нет.. что тут поделаешь.. тогда тут надо писать об этом в методике прямо, снижать требования возможно к валидации и т.д. Именно поэтому то методики и не воспроизводятся - потому как факты экспериментальные все скрывают, не пишут в статьях.. а не пишут, потому что тогда методику тогда придется признать негодной.. замкнутый круг.. надо что-то в консерватории менять)) и у нас, и у них - сейчас ситуация у всех довольно похожая

Так будет ли значимо влиять на селективность (кроме pH) температура при анализе на смешанных колонках (ОФ+ионо-обменная)? или каждый случай требует отдельного рассмотрения.

Вообще эту тему я создал с той идее, что вообще люблю разбираться в самых основах.(также мне понравилась тема созданная Serga про хвосты пиков на хроматограмме) И кроме того мне не нравится когда используют метод научного тыка при подборе состава элюента, на мой взгляд в том и знание хроматографиста чтобы за минимальное количество вариации прийти к нужным условиям за минимум ходов, прогнозируя поведения аналита опираясь на его структурную формулу, свойства компонентов элюента и т.д.

Регулирование температурой я все-таки склонен нелюбить по той же причине, что и регулирование при помощи рН. То есть значительно интереснее, когда метод дает большую стабильность (например, при разумной и предсказуемой гибкости), чем гибкость непредсказуемая впринципе. А регулирование температурой - это как раз из этой серии, т.е. изменение селективности практически непредсказуемо. Этот способ используют когда опять же выхода нет, например, довольно часто в хиральной вэжх селективность очень зависит от температуры и это используют уже плюя на стабильность. А так повышение температуры я рассматриваю как способ понизить вязкость, соотв.повысить скорость и сократить время. Это возможно, опять же, только в том случае, когда селективность еще как-то держит себя а руках, хотя бы последовательность элюирования не меняется.

Не знаю что там конкретно в этом смешанном режиме.. мне кажется, это уж слишком частный вопрос, им можно заняться когда действительно приспичило.. в обращенке много зависит от конкретного случая.. например, температура критически влиет на селективность гликозидов и других полярных вещей с гидроксилами, амидами и т.д... Изменение температуры на 20С может привести к тому, что вы даже хроматограмму не узнаете.. в смысле, вообще ничего общего и даже отдаленно похожего.. можно, конечно, поиграться и понаходить закономерности.. я этого не делал.. просто времени жаль, есть более интересные темы

Поговорим о переменном составе элюента - градиентный режим анализа.
Даный режим анализа не позволяет повысить селективность, т.е. если на данном сорбенте и при одном качественном составе подвижной фазы вещества не делятся в изократическом режиме,то разделить их в градиентном режиме нельзя. Не так ли?
Если так то градиент может позволить добиться: во-первых, существенного сокращения времени анализа при сильно отличающихя времен выхода аналитов, во-вторых повысить чувствительность (сузив пики, можно ли это считать повышение эффективности системы?)
Вот и всё, по-большому счёту или я чего-то забыл.

Ооо.. ну это очень широкая тема.. здесь надо совсем конкретно смотреть.. Во-первых, градиент может менять селективность - как это ни странно.. это бывает редко, но по закону подлости довольно метко.. и опять же, такое чаще случается если режим удерживания - смешанный..

Мне кажется, что плавный градиент нужен только для скрининга. В других же случаях.. наверное, иногда можно применять ступенчатый, когда нужно объединить несколько изократов в один анализ..

Только что почитала дискуссию о влиянии рН и содержании солей в составе элюента на хроматографическое поведение сорбатов. Если коротко, то состав элюента должен обеспечивать стабильное воспроизведение хроматографического удерживания. Для этого ионогенные в-ва в образце должны быть в строго ионизированной форме при конкретном значении рН. Поэтому, как правило водный компонент – буффер с определенным значением рН Как правило это стандартные буфферные рвстворы рН 2.5, рН 5.5 (фосфатный, ацетатный буффер) .... Стандартные рН трудно сдвинуть даже при неточном приготовлении элюента. Удерживание кислот уменьшается с увеличением рН с 2.5 – 7.0 , оснований – наоборот. Нейтральные сорбаты не меняют удерживание от изменения рН. В итоге изменение рН может быть не менее значимым фактором, чем содержание ацетонитрила в элюенте. рН также сильно влияет на форму хром. пика. Вот почему кислоты имеют симметричные пики при рН 2.5, а основания при нейтральных рН. Изменяя рН вы можете резко изменять селективность: кислота и основание могут поменять порядок элюирования на противоположный. Нейтральные останутся на своих местах.

Ольга писал(а):Только что почитала дискуссию о влиянии рН и содержании солей в составе элюента на хроматографическое поведение сорбатов. Если коротко, то состав элюента должен обеспечивать стабильное воспроизведение хроматографического удерживания. Для этого ионогенные в-ва в образце должны быть в строго ионизированной форме при конкретном значении рН. Поэтому, как правило водный компонент – буффер с определенным значением рН Как правило это стандартные буфферные рвстворы рН 2.5, рН 5.5 (фосфатный, ацетатный буффер) .... Стандартные рН трудно сдвинуть даже при неточном приготовлении элюента. Удерживание кислот уменьшается с увеличением рН с 2.5 – 7.0 , оснований – наоборот. Нейтральные сорбаты не меняют удерживание от изменения рН. В итоге изменение рН может быть не менее значимым фактором, чем содержание ацетонитрила в элюенте. рН также сильно влияет на форму хром. пика. Вот почему кислоты имеют симметричные пики при рН 2.5, а основания при нейтральных рН. Изменяя рН вы можете резко изменять селективность: кислота и основание могут поменять порядок элюирования на противоположный. Нейтральные останутся на своих местах.

Все точно так но я хочу сделать ремарку по поводу "Удерживание кислот уменьшается с увеличением рН с 2.5 – 7.0 , оснований – наоборот". Видимо, здесь имеются в виду формально обращенно-фазовые условия. Так вот, на С18 фазах с традиционной селективностью это так. Но на С16-амиде, или с полярным эндкеппингом и прочей полярной чушью может произойти "странная" штука - удерживание заряженной формы будет убывать очень медленно, или вообще не изменяться, а на полимерных фазах типа метакрилата - даже расти. Там при формально "обращенно-фазовых" условиях доля удерживания по "полярным" механизмам может быть весьма высока.